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PCR组分及反应条件初探

发表时间:2017-08-18

来源:北京卓诚惠生

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一、PCR技术的简介
1985年美国Mullis发明了聚合酶链反应(PCR)技术,这是一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法。PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加,从而使得无法直接检测到的目标达到可检测的目的。同其他传统技术相比,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此,PCR技术在建立的短短几十年中,便迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域。
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二、PCR反应的组成及影响
 
一般来讲,PCR反应体系由“五元素”组成:缓冲液(buffer)、扩增引物、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)和模板
 
1、缓冲液:标准的缓冲液含10mM Tris·HCl ,pH 为8.3-9.0(室温),而在延伸温度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用Mg2+ ,有时使用 Mn2+ 。
 
Mg2+ 为Taq聚合酶所必需,浓度高低会影响扩增的特异性和产率。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率,提高富含 G+C 模板的扩增效率。
 
2、扩增引物:两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
 
引物设计不当则特异性差,非特异扩增产物增加,甚至不扩增出所需目标片段。引物浓度的增加,可能出现弥散背景或扩增带发生减弱或缺失。
 
3、DNA聚合酶:PCR所用的酶主要有两种来源:Taq(热稳定DNA聚合酶)和Pfu(高保真DNA聚合酶),分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配(热启动酶是Taq经过修饰的酶)。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。
 
 酶量偏高则会出现很多非特异性扩增,比如引物二聚体、非目的片段等,甚至抑制PCR反应。酶量过低则合成产物量减少。
 
4、脱氧核苷三磷酸:DNA 合成的“原料”。标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ,即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ,终浓度一般为 200mM(即饱和浓度)。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。
 
四种dNTP浓度过高将使掺入错误增高,浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。反复冻融也会影响dNTP的扩增效果。
 
5、模板:对于一般的 PCR 扩增,104至107个模板分子可达到满意的检测效果。以细菌、质粒的 DNA 作模板时,要达到这么多拷贝数分别需要 1ng,1pg 。
 
合适的模板浓度很重要,过低的浓度可能无法实现扩增,而过高可能降低扩增效率。
 
三、PCR反应条件及影响
 
一般来讲,完整的PCR过程有:预变性、变性/退火/延伸的循环、充分延伸。
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1、预变性:模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般Taq酶激活时间为2-10分钟。
 
2、变性:循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。
 
3、退火:退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,通过梯度退火实验摸索最佳的退火条件。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
 
4、延伸:引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略(如在实时荧光PCR中,一般省略此步骤)。延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,设定为1min/kb。
 
5、循环数:大多数PCR的循环数设置为25-35。循环次数太少可能因模板浓度过低而检测不到待扩增目标,而循环次数太多易产生非特异扩增。
 
6、最后充分延伸:在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
 
Tips
 
1、PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油,减少PCR过程中液体蒸发所造成的产物的丢失。(此法可同时解决老型号的PCR仪因需要手动设置热盖的启动造成的PCR扩增失败)
 
2、使用UDG酶可以避免PCR产物开盖检测带来的污染。在dNTP中用dUTP替代dTTP,UDG酶存在于反应混合液中,其它所有反应成分保持不变。PCR反应的DNA链延长过程中DNA聚合酶用dU代替了dT,因而产物DNA序列中含有dU而不是dT,在新样品进行反应前,它们首先面临的是UDG。含有U的DNA链一旦遇上UDG酶,这些U就会被切除而使该链具有缺刻。在接下来的PCR加热过程中,有碱基缺失的DNA链分开后不能够被扩增。
 
文章内容由北京卓诚惠生技术支持部整理提供

 
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