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qPCR常见问题及分析解决方法

发表时间:2017-01-20

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做过PCR的童鞋们都知道要想完全hold该实验、成为真正的PCR达人,并非易事。就qPCR而言,似乎其中的每一环节都可以让整个实验挂掉,也因此成为了资深科研狗们心中的痛。今天小编就整理了一些有关qPCR常见的问题及分析解决办法分享给大家。

那什么是qPCR呢?
qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称qPCR。

简单来说,qPCR就是利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。而常规的PCR是无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时监测。

qPCR的疑难杂问

Q1 如何提高RT-PCR反应的灵敏度与特异性?

Answer:

1. 首先确定模板RNA完整性好,无DNA污染。

2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。

3. 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

4. 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

5. 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

6. 设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。

Q2 避免RNA降解的方法有哪些?

Answer:

1. 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。

2. 使用良好无污染技术分离RNA。

3. 将组织从动物体取出后立刻提取RNA,并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

Q3 RNA中含有逆转录抑制剂时,怎么处理?

Answer:

逆转录抑制剂包括:SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐,可将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检测RNA抑制剂;若对照RNA与样品混合后产量降低,则说明样品中存在逆转录抑制剂,可用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗,以除去抑制剂。

Q4 如何减少RNA模板中的二级结构?

Answer:

1. 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火;提高逆转录反应温度。

2. 温度超过60℃时,不能使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。

3. RT-PCR产物的长度超过1kb时,反应温度需保持在65℃。

Q5 RNA中有DNA污染的处理方式

Answer:

1. 若是基因组DNA的污染,可使用DNaseI处理RNA; 同时设置没有逆转录的对照组反应检测DNA污染。

2. 若是受到外源DNA的污染,可使用抗气雾剂和UDG酶。

Q6 qPCR探针设计的一般原则有哪些?

Answer:

1. 扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp。

2. 探针不能和任一引物互补,且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短,长度不要超过30bp。

3. 探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度。

4. 探针如用于检测多态位点,多态位点应尽可能靠近探针中部。

5. 探针5’端不能是碱基G,G对荧光基团有猝灭作用。


Q7无反转录酶情况下,对照RNA仍有扩增结果

Answer:

1. 体外转录时不可能将所有DNA模板消除,因而对照组会含有痕量的DNA。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染造成的影响。

2. 可能是引物二聚体的条带。


Q8 扩增产物滞留在加样孔中

Answer:

1. 可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链cDNA浓度稀释至100倍再进行二次扩增。

2. 在二次PCR时,使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。


Q9 无Ct信号出现

Answer:

1. 反应循环参数不够,一般要在35个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值。

2. 检测荧光信号的步骤有误。SYBRgreen法(SG法)采用的是72℃延伸时采集荧光信号,taqman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

3. 引物或探针降解,可用PAGE电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针。

4. 模板不足或降解,则可以重新提取核酸模板。


Q10 Ct值出现过晚(Ct>38)

Answer:

1. 扩增效率低,反应条件不够优化,降低退火温度,增加镁离子浓度。

2. 反应成分降解或加样量不足。

3. PCR产物过长,一般采用80-150bp。


Q11 标准曲线线性关系不佳

Answer:

1. 加样存在误差,是样品浓度不成梯度。

2. 标准品出现降解,避免反复冻融。

3. 引物或者探针设计不佳。

4. 模板中存在抑制物或模板浓度过高。


Q12 溶解曲线存在多个主峰

Answer:

1. 引物设计不够优化。

2. 引物浓度不佳,上下游引物浓度比例不一致。

3. 镁离子浓度过高。

4. 模板基因组的污染。


Q13 同一样品中,其中某一个荧光信号特别强

Answer:

1. 试剂配制时反应液没有完全溶化,导致探针量在一管增多。

2. 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。

3. PCR仪热槽被荧光物质污染,需要清除热槽中的污染。


Q14 扩增曲线有一向上或向下的尖峰?

Answer:

1. 反应过程中电压不稳定。

2. 可能在20个循环左右时,仪器有停下或仪器有开盖,使光线突然增强。

3. 如果尖峰向下,可能是由卤素灯老化所致,这时应更换。


Q15 部分样本扩增效率过低?

Answer:

1. 提取液残留,一定程度抑制了PCR反应。

2. 反应液未严格取量混匀或分装不均匀。

3. 试剂失效。

 

Q16 阴性对照或空白对照翘尾

Answer:

1. 模板提取环境或操作过程有污染。

2. 配液过程存在污染。


Q17 直线型扩增曲线

Answer:

1. 探针部分降解:一般稀释的探针可在4°C保存至少3个月,探针的反复冻融或导致降解;或者探针在光线下暴露时间太长了。

2. 反应液中有PCR抑制物。


Q18 没有扩增曲线

Answer:

1. PCR参数设置错误,在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步,即stage1阶段。

2. 电脑设定了自动休眠。


Q19 基线下滑

Answer:

基线选取范围不对,可试着将基线范围改大一些,这一问题常因试剂质量所致。


Q20 扩增曲线断裂

Answer:

基线选取范围不对,基线终点大于Ct值,这通常是由于模板DNA浓度过高所致,因Ct值<15,而基线范围仍取3-15,其中包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值过高,解决办法:减少基线终点至Ct前4个循环,重新分析数据。


Q21 样品浓度跨度过大

Answer:

样品浓度过高,导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线,其解决方法同“扩增曲线断裂”。


Q22 山坡形曲线

Answer:

常因反应管封口不严,至反应液蒸发所致。

 

注:文章资料来源于分析测试百科网、病理柳叶刀